Stała ekspozycja mieści się w domu rodzinnym Jana Matejki (1838-1893) najwybitniejszego polskiego malarza nurtu historyzmu, kolekcjonera, miłośnika zabytków w szczególności Krakowa. Stara, krakowska kamienica (przebudowywana w XVIII i XIX w.) jest miejscem, w którym urodził się, mieszkał z rodziną, tworzył i zmarł Jan Matejko.
Po śmierci artysty zawiązało się Towarzystwo jego imienia, które postawiło sobie za cel uczczenie osoby wybitnego malarza tworząc muzeum biograficzne jemu poświęcone. Dużym nakładem sił, w wykupionym od rodziny domu zgromadzono drogą systematycznych zakupów i darów różnorodne eksponaty związane z postacią Jana Matejki i jego rodziny, prezentując je po raz pierwszy publiczności już w 1898 roku.
W 1904 roku Towarzystwo im. Jana Matejki przekazało utworzone przez siebie muzeum biograficzne pod zarząd Muzeum Narodowego w Krakowie. Dziś zbiory Domu Jana Matejki liczą około 6000 eksponatów.