Od początków swego istnienia, które sięgają 1880 r., Muzeum gromadziło przede wszystkim zabytki z terenu Bydgoszczy i okolic (wykopaliska archeologiczne, dokumenty miejskie, rzemiosło artystyczne, militaria, broń i medale). W okresie międzywojennym powstał nowy dział - sztuki polskiej (malarstwa, rzeźby i grafiki), ze szczególnym uwzględnieniem twórczości artystów miejscowych. Taki charakter - placówki wielodziałowej - Muzeum Okręgowe w Bydgoszczy zachowało do dziś. Posiada bogate kolekcje rzemiosła artystycznego polskiego i europejskiego, w tym wyrobów z cyny z XII-XX w., porcelany, fajansu i kafli z XVI-XX w., zegarów itp; liczący około 40 000 zbiór monet; dzieła sztuki ludowej z regionów etnograficznych Pałuk, Kociewia i Kaszub. Jednakże wyjątkowe miejsce na mapie muzealnej Polski zajmuje Muzeum dzięki posiadaniu spuścizny po Leonie Wyczółkowskim (1852-1936), malarzu i grafiku, którego twórczość zaliczana jest do najbardziej znaczących zjawisk artystycznych w sztuce polskiej przełomu XIX i XX w. Wdowa po malarzu przekazała Muzeum nie tylko obrazy, rysunki i prace graficzne, ale też wiele pamiątek osobistych i wyposażenie pracowni malarza. Zbiór ten został potem uzupełniony dziełami i pamiątkami, które znajdowały się w rękach rodziny bliskiego przyjaciela Wyczółkowskiego. Nic zatem dziwnego, że otwarte ponownie po wojnie 11 kwietnia 1946 r. - w rocznicę urodzin Wyczółkowskiego - Muzeum przyjęło imię tego malarza i że istnieje w nim specjalny dział, w którym obecnie znajduje się 700 prac artysty. Gromadzone są też obrazy, rysunki, grafiki oraz rzeźby z XIX i początku XX w., a zwłaszcza prace artystów polskich powstałe po 1945, które obecnie tworzą Galerię Współczesnego Malarstwa Polskiego, uważaną za jedną z najbardziej reprezentatywnych w kraju.

W siedzibie głównej (przebudowanym w XIX w. budynku XVII-wiecznego klasztoru) prezentowane są zbiory działu sztuki i działu biograficznego Leona Wyczółkowskiego. Poza tym wystawy organizowane są w dwóch zabytkowych spichrzach na Wyspie Młyńskiej: w tzw. Czerwonym Spichrzu - sztuki współczesnej; w "Białym Spichrzu" przy ul. Mennica 2 - archeologiczne, numizmatyczne i etnograficzne oraz stała ekspozycja rzemiosła cechowego i artystycznego.